В процессе репликации отдельные нуклеотиды связываются с молекулой ДНК (которая работает шаблоном) при помощи специфических водородных связей (аденин – с тимином, а гуанин – с цитозином), а ферменты соединяют эти новые строительные элементы друг с другом, словно какая-нибудь швейная машина.
Когда образуется вторая цепочка ДНК, комплиментарная первой, два сегмента можно разделить простым нагреванием смеси. Дальше процесс можно начинать сначала. В процессе ПЦР это достигается сначала повышением температуры до 95 °C (чтобы разделить две цепочки ДНК), затем понижением ее примерно до 50 °C для соединения со специфическими праймерами, затем новым повышением до 72 °C – это так называемая стадия удлинения, когда к растущей цепочке по одному прибавляются нуклеотиды согласно модели, комплиментарной шаблону. Обычно протокол ПЦР включает 30–35 таких циклов. На каждом цикле количество молекул ДНК удваивается. Нетрудно подсчитать, что к концу реакции одна молекула может дать (по крайней мере, в теории) до миллиарда идентичных цепочек ДНК.
У реакции есть слабое место – высокая температура, необходимая для разделения двух цепочек. Такие жесткие условия, да еще повторенные несколько раз, влияют на работоспособность ферментов, которые, будучи белками, легко денатурируются при нагревании. На самом деле ключевым элементом, превратившим полимеразную цепную реакцию в ценный практический инструмент, стала именно доступность ферментов (в данном случае полимераз), выдерживающих высокие температуры.
Возможность изолировать такие ферменты стала следствием еще одного, более масштабного биологического открытия – организмов, способных выживать в очень суровых условиях. Чаще всего это микроорганизмы, очень уместно именуемые экстремофилами, – они действительно живут в условиях, несовместимых с существованием других живых существ: например, в горячих источниках, где температуры бывают очень высоки. В тех из них, что расположены в глубинах океанов, были зафиксированы температуры вплоть до 120 °C. Другие микроорганизмы, напротив, предпочитают сильный холод или, скажем, высокие концентрации хлорида натрия (обычной поваренной соли) – их в свое время обнаружили в бассейнах для выпаривания соли. Как ни удивительно, некоторые формы жизни действительно хотят жить в таких экстремальных условиях и гибнут, если перенести их в нормальную среду.
Открытие ПЦР стало краеугольным камнем науки и могущественным исследовательским инструментом, позволившим производить анализ микроскопических образцов ДНК, которые до тех пор никак не давались ученым и понижали порог детекции в миллионы или даже миллиарды раз.
Влияние ПЦР на общий научный прогресс можно сравнить с микроскопом или телескопом, которые колоссально расширили наше поле экспериментального наблюдения. Эта техника позволила наконец сделать предметом анализа ничтожно малые образцы тканей и благодаря такой беспрецедентной чувствительности нашла себе применение, например, в судебно-медицинской экспертизе, где отпечатка пальца или одного волоска теперь достаточно, чтобы выяснить личность человека.
После амплификации гена его можно секвенцировать гораздо быстрее и легче, чем белок: для этого достаточно нескольких часов в противовес нескольким месяцам. Последовательность гена теперь запросто показывает расположение аминокислот по всей длине белка. Методы молекулярной биологии сделали возможным секвенцирование большого числа ОСБ, даже когда количество изолированного из натурального источника белка слишком мало для традиционных биохимических методов, как это бывает, например, с насекомыми.
Третий шаг: трехмерная структура
Еще один превосходный инструмент, за который мы благодарны молекулярной биологии, – возможность синтезировать большие количества искомого белка, заражая бактерию или другой организм геном с его кодом и предоставляя ей производить его самостоятельно. Доступность ОСБ в масштабе миллиграммов дала ученым шанс изготовить кристаллы, чья трехмерная структура нашла применение в рентгеновской дифракционной спектрометрии.
Из-за стремительного развития этих техник в нашем распоряжении теперь есть масса информации о структуре ОСБ, об устройстве лигандо-связывающей полости и способе ее взаимодействия с пахучими веществами и феромонами. Сейчас нам известны без преувеличения тысячи секвенций ОСБ, принадлежащих и насекомым, и позвоночным, а для некоторых из них уже открыты и трехмерные структуры. Более того, вся эта информация и сильно шагнувшие вперед биоинформатические средства привели к возможности моделировать новый белок просто по его последовательности аминокислот – при условии, конечно, что он достаточно похож на других членов того же семейства с уже известной структурой. Структура белка действительно имеет фундаментальное значение, так как напрямую связана с его физиологической функцией. Часто первое представление о роли белка в организме мы получаем именно по его трехмерной укладке.
На этом этапе нам, видимо, придется на время забыть об истории запахов и ольфакторных белков и углубиться на некоторое время в их структурные элементы и то, как они связаны с биологическими функциями.
Форма белков
Новорожденный белок, только что синтезированный клеточной машинерией, выглядит как длинная цепочка аминокислот, соединенных между собой ковалентными связями между карбоксильной группой каждого юнита и аминогруппой следующего за ним, – примерно как люди, которые стоят длинной шеренгой и держатся за руки. У каждой аминокислоты, помимо аминогруппы и кислотной группы, есть боковая цепочка. Она может быть очень простой – один атом водорода или короткая углеводородная цепочка, – а может содержать другие функциональные группы, в том числе вторую аминовую или вторую карбоксильную. В природе существует 20 аминокислот, из которых строится все разнообразие белков, и большинство их есть в каждом белке. Белки отличаются друг от друга в том числе и относительным объемом аминокислот, но прежде всего – расположением звеньев в цепи, и последовательность эта совершенно уникальна для каждого белка. Она закодирована в ДНК и определяет трехмерную структуру белка, которая в свою очередь отвечает за его физиологические функции.
После синтеза цепочка сворачивается или складывается неким неповторимым образом, хотя на первый взгляд белок может показаться просто случайным образом запутанной веревочкой. Взаимодействия между функциональными группами складывают белок сначала по маленьким доменам, а затем все это организуется в окончательную трехмерную структуру. Самые распространенные домены – спирали и складчатые листы. Эти структурные элементы соединяются между собой более короткими и гибкими сегментами, а потом собираются в финальную форму белка. Домены сами по себе сравнительно малы и состоят обычно из 10–20 аминокислот.
Водородные связи играют важнейшую роль в стабилизации и спиралей, и складчатых листов, а также участвуют в соединении доменов друг с другом. Имеют значение также и другие связи – более сильные, между противоположными зарядами, и более слабые, гидрофобные. Поскольку белки обычно находятся в водной среде, самые лучшие структуры аминокислотных цепочек – те, в которых гидрофобные остатки спрятаны внутри молекулы, а заряженные или гидрофильные находятся на поверхности.
