К тому же оставалась еще масса вопросов относительно физиологических аспектов такого рецептора. Как химический сигнал переводится в электрические импульсы? Как нейроны ольфакторной слизистой оболочки связаны с высшими областями мозга, отвечающими за восприятие и поведение?
Однако первым делом наша лаборатория должна была добиться ясных и точных результатов. В то время мы близко общались с коллегой по имени Кришна Персо – он работал в Уорикском университете (Англия), в лаборатории Джорджа Додда. Кришна тоже сходил с ума по этой теме, и мы вместе с ним решили сосредоточить усилия на поисках рецептора андростенона. Мы еще раз провели все те же эксперименты и получили прежние неубедительные результаты. Странным образом данные наших двух лабораторий во многом повторяли друг друга, а вот с той публикацией решительно расходились.
Потратив несколько месяцев на борьбу с андростеноном – неизменно с отрицательным результатом, – я решил бросить этот одорант и выбрать какой-нибудь другой, более гидрофильный.
Любопытно, что и по сей день те опубликованные данные никому не удалось повторить; судя по всему, принесшие их опыты были проведены некорректно.
Неожиданное открытие
Сидя на пепелище своего великого андростенонового провала, я принялся искать нового кандидата, который не обладал бы неудобной гидрофобностью этого стероида. Выбор пал на еще один мощный одорант, 2-изобутил-3-метоксипиразин, с его знаменитым запахом сладкого перца. Эта молекула обладает ароматом не менее (а возможно, и более) интенсивным, чем у андростенона, но при этом гораздо более гидрофильна. Это тоже маслянистое вещество, которое теоретически должно бы считаться нерастворимым. Однако по меньшей мере один грамм его можно растворить в литре воды – а это куда больше, чем требовалось для наших биохимических экспериментов. Как и с предыдущим нашим кандидатом, исключительно мощный запах этого пиразина предполагал, что у него должны быть совершенно особые отношения с ольфакторными рецепторами.
Я начал с самого начала и синтезировал пиразин, чтобы его можно было радиоактивно промаркировать. На сей раз лаборатория наполнилась свежим и куда более приятным ароматом – не чета затхлой вони андростенона. Но, сколь бы приятен и натурален ни был этот сладкий перец, им вскоре пропах весь отдел. Все, что попадало в холодильник, где хранился образец пиразина, скоро приобретало тот же узнаваемый аромат. Казалось, запах чудесным образом умножается, словно какой-нибудь вирус, и постоянно завоевывает новые территории. Простые вычисления, основанные на исключительно низком ольфакторном пороге этого дивного вещества, показывают, что одной-единственной капельки, всего в несколько миллиграммов, достаточно для ароматизации большого здания.
Но что касается экспериментов, с пиразином все оказалось решительно по-другому. Результаты явились мгновенно и были ясны и воспроизводимы. Уже через пару недель у меня накопилось достаточно данных, чтобы показать коллегам в Уорике, – я был очень горд собой. Впрочем, очень скоро стало понятно, что с ними все-таки что-то не так, – и я никак не мог сообразить, что именно. Слишком уж просто все выглядело. Все предвиденные трудности разрешились сами собой. Для верности я несколько раз повторил эксперимент: воспроизводимость была превосходна. Кривая насыщенности, низкий фон (основная трудность с андростеноном) и масса материала для работы. В этом-то и заключалась главная проблема: предполагаемого рецептора наблюдалось как-то уж слишком много.
Я наскоро подсчитал соотношение количества ольфакторных нейронов на квадратный сантиметр слизистой к общей площади реснитчатой мембраны. Даже если бы вся ее поверхность была сплошь покрыта белками-рецепторами, на каждый ольфакторный все равно приходилось бы в 10 000 раз меньше места, чем получалось по нашим данным.
Существовало только одно объяснение такому феномену, хотя принять его было и нелегко: наш белок на самом деле не был ольфакторным рецептором. Это мог оказаться любой белок, по случайному совпадению обладающий сродством с молекулой-датчиком. Это был настоящий эмоциональный шок. Я просто не мог допустить, чтобы холодные научные данные развеяли эйфорию предшествующих недель. Неужто мы и правда потратили столько времени на белок, не имеющий ни малейшего отношения к обонянию?
Несколько простых экспериментов по связыванию с экстрактами других тканей должны были показать, действительно ли искомая активность имела место только в носу. Это совершенно обычная процедура, когда хочешь соотнести биохимические данные с физиологией и понять, как работает тот или иной конкретный белок. Поэтому мы взяли для анализа ткани из печени, мозга, селезенки, легких и некоторых других органов. Все они показали отрицательный результат: мы смогли с уверенностью заключить, что способность связывать пиразин эксклюзивно принадлежала назальной ткани. Получалось, что бы мы там ни измеряли, оно явно имело отношение к обонянию. Значит, не все еще потеряно. Мы, по крайней мере, открыли что-то интересное, пусть даже и не соответствующее модели.
Мы решили проверить наш пока еще неизвестный белок еще раз. Когда идентифицируешь новый рецептор, одним из самых убедительных аргументов в его пользу будет то, что твой препарат in vitro распознает разные лиганды не менее эффективно, чем натуральный рецептор in vivo
[6]. Физиологическими данными, подлежащими сравнению с биохимическими, в данном случае были ольфакторные свойства летучих молекул – описания запахов и обонятельные пороги. Самое время воспользоваться богатством научных знаний, накопленных за последние десятилетия.
В этой перспективе пиразин был очень удачным выбором: он и похожие на него соединения – важный класс пищевых одорантов, и занимающиеся ольфакцией ученые весьма пристально ими интересовались.
Мы взяли несколько соединений со сходной химической структурой, но разными ароматами. Пиразины и здесь не подвели: у них простые, относительно жесткие структуры, допускающие небольшие манипуляции с молекулами, – проверять их эффект на уровне запаха очень удобно. Этому были посвящены многочисленные исследования, обеспечившие достаточно данных и установившие прочную связь между структурой вещества и его запахом.
Изменения в длине углеводородной цепочки 2-алкил-3-метоксипиразинов в особенности радикально влияют на запах. Если производные с метиловой и этиловой группой пахнут орехами и жареным мясом, наличие последовательности из трех и более атомов углерода сразу придает соединению зеленый растительный (и гораздо более сильный) запах.
Сравнив между собой зеленые и ореховые пиразины, мы обнаружили, что эти два класса веществ ведут себя совершенно по-разному. Результаты экспериментов нас порядком взволновали – они оказались в точности такими, как мы надеялись: наш загадочный белок, чем бы он там на самом деле ни был, распознавал разные пиразины по запаху. Тогда мы решили сделать следующий шаг и проверить в рамках того же протокола другую серию веществ – алкил-замещенные тиазолы. У них производные с короткими цепочками (один или два атома углерода) тоже пахнут орехом и горелым, а прирост длины цепочки дает соединения с зеленым запахом. И снова эксперименты по связыванию полностью соответствовали ольфакторным данным.
