Раствор, содержащий рецептор, который мы хотим проанализировать, смешивается с радиоактивным лигандом до состояния равновесия. На этом этапе часть лиганда уже связана белком-рецептором, а часть остается свободной в растворе. Пропорция между двумя концентрациями зависит от сродства рецептора лиганду. Как же нам измерить концентрации свободных и связанных лигандов? Нужно прежде всего отделить свободный лиганд от связанного белком. Для этого применяются разные техники фракционирования по молекулярной массе. Свободный лиганд окажется во фракции с низкой молекулярной массой, а связанный отправится вместе с белком во фракцию с высокой. Такими методами ученые пользовались в конце 1970-х для идентификации и изоляции белков-рецепторов. Тогда их занимали в основном рецепторы гормонов (в особенности стероидов) и нейротрансмиттеров – такие как ацетилхолиновый или β-адренэргический.
Принимая гипотезу, что ольфакторные рецепторы, как и рецепторы всяких других молекул, являются белками, невольно задаешься вопросом: что же заставило биохимиков так долго чураться этой новой интересной области научного знания? Казалось бы, они вечно ищут новые идеи, новые неизведанные территории. Кто из них не мечтает первым открыть новую молекулу, закон физики или необычный физиологический эффект?
Основная причина заключалась, скорее всего, в том, что всякая новая область исследований означает огромный риск. На ученую братию постоянно давит необходимость публиковаться, чтобы в будущем иметь возможность запрашивать финансирование; для оригинальных новаторских проектов зачастую просто нет места. А при подаче на финансирование всегда важно заявлять проект, твердо стоящий на ногах и обещающий на выходе конкретные, практически применимые результаты. Новый проект, основанный исключительно на идеях, имеет исчезающе малые шансы получить деньги.
Ну и конечно, биохимики не торопились углубляться в сферу обоняния по той простой причине, что там все очень уж сложно устроено. Даже при тогдашних ограниченных знаниях опытные химики не могли не догадываться, что ольфакторная система – не чета простому зрительному коду и должна быть основана на огромном количестве рецепторов. А вот количество белков-рецепторов каждого типа, напротив, должно быть очень невелико. Таким образом, биохимики, желающие посвятить свою жизнь ольфакции, столкнулись бы с серьезной задачей – не только идентифицировать один-единственный специфический белок, присутствующий в крошечных количествах (заметно ниже порога чувствительности тогдашних инструментов и техник), но и сепарировать его от сотен других структурно схожих белков. Средств для решения такой задачи у науки не было.
Учитывая такое положение дел в конце 1970-х, отсутствие интереса к охоте на ольфакторные рецепторы на белковом уровне не должно никого удивлять. Фактически было предпринято всего несколько попыток, да и те оказались безуспешными. В любом случае результаты, полученные в единичных лабораториях, никто не повторил и не подтвердил, а вскоре они и вовсе утратили надежность и достоверность в глазах научного сообщества.
Сегодня, в свете новых знаний, полученных благодаря продвинутым техникам молекулярной биологии, задача эта для тех времен представляется совершенно безнадежной. Рецепторы мембраны составляют слой на поверхности клетки толщиной в одну молекулу, то есть количественно их гораздо меньше, чем белков внутри самой клетки. Вдобавок в одном образце ткани содержится очень много белков-рецепторов с очень похожими свойствами.
Помимо всех этих проблем, общих для рецепторов вообще и ольфакторных в частности, сама задача изолировать конкретный белок отнюдь не проста. Для этого нам нужно отделить его от огромного множества других белков с практически теми же химическими свойствами. Все белки представляют собой длинные цепочки, построенные из одних и тех же 20 кирпичиков-аминокислот, связанных друг с другом в линейную последовательность, постоянную и типичную для каждого белка. Иными словами, белки отличаются друг от друга длиной цепочки, а также пропорцией и расположением этих самых 20 аминокислот. Поскольку некоторые аминокислоты имеют электрический заряд, белки можно различать еще и по общему заряду, и вдобавок по размеру молекулы. Это две основные характеристики, позволяющие фракционировать белковую смесь. Если искомый белок – один из пропорционально малых компонентов смеси, его изоляция может оказаться делом довольно трудным и требовать фракционирования в несколько этапов.
Вторая проблема с ольфакторными рецепторами заключалась в отсутствии надежного функционального теста на их присутствие. К концу 1970-х рецепторов насчитывалось не так уж много. Для каждого был известен специфический лиганд, который сравнительно быстро и просто показывал наличие белка-рецептора еще на стадии изоляции.
А вот с ольфакторными рецепторами лиганды представляли большой вопрос. Всякая летучая молекула, способная добраться до нашей обонятельной слизистой, есть потенциальный одорант и кандидат в лиганды для ольфакторных рецепторов. Однако далеко не все одоранты порождают одинаково сильные обонятельные ощущения. Многие соединения пахнут очень слабо, другие – довольно интенсивно. Среди последних – пиразины с запахом сладкого перца, земляной геосмин и андростенон с его всепобеждающим едким запахом мочи [3].
Эти молекулы способны стимулировать наши рецепторы даже в исключительно низких концентрациях, а следовательно, являются самыми сильными лигандами – каждый для своего избирательного рецептора. Эти вещества, по логике вещей, должны быть более специфичными, чем остальные, и служить наживкой для отлова соответствующих им рецепторов. В самом начале пути наши биохимические исследования основывались именно на этой идее. Сами понимаете, как важно было на этом этапе иметь в своем распоряжении весь объем накопленной за предыдущие десятилетия информации с описанием запахов и ольфакторных порогов.
Увы, с главной проблемой – как изолировать один конкретный рецептор среди сотен белков того же класса – все оставалось по-прежнему. Нелегко было изолировать нужное количество даже у крупного животного – такого как свинья или корова. Простые подсчеты, основанные на площади ольфакторной области (даже предполагая, что эта область будет целиком покрыта белками-рецепторами), возвращают коэффициент примерно в сто микрограммов – это максимальное количество ольфакторных рецепторов в носу одного животного крупного размера. Далее эту цифру нужно поделить на предполагаемое количество типов ольфакторных рецепторов (более 300 у людей и ближе к 1000 у других животных, как выяснилось впоследствии) и так получить среднее количество для каждого типа рецептора. Любой опытный биохимик сказал бы вам, что задача эта совершенно нереалистична, и не стал бы и думать про инвестиции в такое неблагодарное исследование.
В поисках ольфакторных рецепторов
В те времена я был еще юн, неопытен (особенно в биологии, так как образование получил в неорганической химии) и совершенно лишен финансирования. Рисковать мне было нечем, а невежество не давало толком разглядеть, в какое абсурдное предприятие я намерен ввязаться. Если бы я только остановился на минутку и подумал о последствиях; если бы спросил авторитетного совета или провел более подробные предварительные исследования; если бы, наконец, был постарше и поопытнее, я бы наверняка не узнал тех волнительных и радостных мгновений, что выпали мне на долю в следующие 35 лет, – как не узнал бы и разочарований, провалов и неудач, верных спутников повседневной жизни ученого.
