• 3`–5` экзонуклеазы проверяют точность копирования за ДНК-полимеразами и удаляют неправильно вставленные нуклеотиды;
• топоизомеразы не дают ДНК запутаться в беспорядочный клубок. Эти белки совершают небольшое чудо, которое вызовет зависть у любителей шитья и вязания: пропускают одну нить ДНК через другую, так что обе нити в итоге остаются целыми;
• белок-застежка (он еще называется «скользящий зажим», или сlamp) удерживает всю конструкцию репликативной вилки на ДНК;
• репликационный фактор С (он же белок-погрузчик скользящего зажима, или Сlamp loader) с затратой энергии АТФ защелкивает его в начале репликации;
• в составе репликативной вилки могут быть структурные белки, образующие «скелет» ее конструкции, но не имеющие ферментативной активности. Например, у дрожжей и животных это комплекс GINS из четырех белков.
У вирусов можно встретить большое разнообразие систем репликации. Вирусы с большим геномом, например бактериофаг Т4 (170 000 нуклеотидов), имеют репликативные вилки, похожие на клеточные, но устроенные несколько проще. Одноцепочечные участки ДНК и РНК длиной до 10 000 нуклеотидов достаточно устойчивы, поэтому для вирусов с малыми геномами репликативная вилка не нужна. Они могут использовать самые разные варианты системы репликации. Например, механизм репликации «катящегося кольца» при помощи одной молекулы полимеразы производит длинную одноцепочечную молекулу ДНК, содержащую много линейных копий кольцевой матрицы. Потом эти копии разделяются и замыкаются в кольца при помощи ферментов рекомбинации. У ряда вирусов в качестве затравки (праймера) для начала новой цепи может использоваться не РНК, а специальный белок. Наконец, бывают ретровирусы, у которых ДНК строится на матрице РНК, а РНК – на матрице ДНК, т. е. два типа геномного материала чередуются в жизненном цикле. Более того, многие вирусы используют для своей репликации ферменты хозяина, заставляя их работать в нештатном режиме. Например, у бактериофага лямбда репликация по механизму «катящегося кольца» идет при помощи ДНК-полимеразы клетки-хозяина, в норме работающей в составе репликативной вилки. Так что контекст, в котором работают ДНК-полимеразы, может легко и быстро меняться в ходе эволюции.
Система репликации ДНК в клетках причудливо сочетает компоненты, унаследованные от LUCA, с независимо возникшими (табл. 14.1). Удивительно, что меньше всего сходства между бактериями и археями есть в самых главных компонентах репликативной вилки – ДНК-зависимой ДНК-полимеразе и праймазе. ДНК-полимеразы архей и бактерий не имеют в своей структуре ничего общего. Бактериальные праймазы родственны двум семействам хеликаз, а архейные праймазы не обнаруживают сходства ни с какими другими белками.
Другие компоненты репликативной вилки, хотя имеют сходство у бактерий и архей, но скорее всего, независимо приняли одинаковые функции. Например, работающие в репликации хеликазы всех организмов относятся к одному суперсемейству Р-петли (P-loop ATPase). Но в этом суперсемействе архейные хеликазы ближе к I семейству РНК-хеликаз, а бактериальные хеликазы – к белкам запуска репликации RecA. Проверочные 3' – 5' ДНК-экзонуклеазы относятся к одному большому суперсемейству, но архейные и бактериальные ферменты в нем ближе к разным семействам РНК-экзонуклеаз, чем друг к другу. SSB-белки бактерий и архей тоже принадлежат к одному семейству OB-укладки, куда входят различные ДНК– и РНК-связывающие белки. Однако архейные SSB-белки в пределах этого семейства ближе к аминоацил-тРНК-синтетазам, чем к своим бактериальным аналогам.
Многие вспомогательные компоненты репликативной вилки имеют общее происхождение у бактерий и архей: ДНК-лигазы, скользящий зажим, загрузчик скользящего зажима. РНКазы Н бактерий и архей тоже сходны и имеют общее происхождение, но не обязательно от LUCA. Этот же фермент есть и у ретровирусов. Он мог независимо попасть от них в клетки бактерий и архей.
Общее происхождение скользящего зажима и его погрузчика означает, что структура репликативной вилки, копирующей одновременно две цепи, могла существовать у LUCA – для более простых механизмов, например «катящегося кольца», скользящий зажим и ферменты его погрузки не требуются. Существование репликативной вилки указывает на большие геномные молекулы длиной более 100 000 пар нуклеотидов. Наличие у LUCA ДНК-лигазы и ДНК-зависимой РНК-полимеразы означает, что ДНК в какой-то форме у него уже была. Но принципиально разные ДНК-полимеразы и праймазы бактерий и архей объяснить труднее.
Возможны три основных объяснения:
1) LUCA имел обе версии системы репликации ДНК одновременно, бактерии унаследовали одну, археи – другую;
2) LUCA имел одну из современных систем репликации, в одной из двух линий потомков она была заменена на новую;
3) система репликации LUCA принципиально отличалась и от бактериальной, и от архейной, обе линии потомков ее заменили на современные варианты.
Leipe, Aravind, Koonin (1999) тогда сделали выбор в пользу третьего варианта. По их предположению, LUCA имел гетеродуплексный ДНК-РНК геном, в двухцепочечной форме которого была одна цепь РНК и вторая – ДНК. Такие двойные спирали из разных цепей называются гетеродуплексами. ДНК-РНК-гетеродуплексы прочнее, чем РНК и метил-РНК. Предполагаемый механизм репликации показан на рисунке 14.5 Б. Clamp и Clamp Loader – скользящий зажим и его погрузчик исходно могли помогать обратной транскриптазе не отделяться от копируемой цепи до окончания копирования. Нельзя, впрочем, исключить и другой вариант: у LUCA была репликативная вилка, и в ней работали вместе обратная транскриптаза и ДНК-зависимая РНК-полимераза.
Предположение о гетеродуплексном геноме LUCA легко объясняет, почему бактерии и археи имеют неродственные ДНК-полимеразы. Копировать двухцепочечную ДНК напрямую надежнее, чем через промежуточную стадию РНК, поэтому замена обратной транскриптазы на ДНК-зависимые ДНК-полимеразы была поддержана отбором в линиях бактерий и архей. Это предположение хорошо согласуется и с данными по РНК-полимеразе и ее вспомогательным белкам. Если РНК-полимераза делала молекулы РНК размером в целый геномный фрагмент, то начало и окончание ее работы должны были регулироваться не так, как в современных клетках. Казалось бы, все понятно, но последующие открытия только запутали картину.
Разнообразие и происхождение ДНК-полимераз
В работе Лейпе с соавторами не был учтен тот факт, что все клетки имеют как минимум две ДНК-полимеразы – главную и вспомогательную. Главная полимераза делает основную работу по копированию генома, а вспомогательная заполняет ДНК пустые места на месте удаленных РНК-затравок и поврежденных участков генома. У архей главная и вспомогательная ДНК-полимеразы обычно родственны друг другу и имеют похожие трехмерные структуры, а вот у бактерий две ДНК-полимеразы не похожи ни на архейных «коллег», ни друг на друга. Большинство клеточных полимераз относятся к трем семействам: PolA, PolB и PolC.
