Благодаря вирусам можно обойти еще одно сложное место на пути от РНК-геномов к ДНК-геномам. Как мы говорили выше, частота мутаций складывается из двух факторов: ошибки при копировании генома и повреждения геномных молекул между копированиями. Переход от РНК к ДНК снижает уровень повреждений между копированиями, но частота ошибок копирования в момент перехода должна возрасти! При смене типа геномного материала нужны перестройки фермента-полимеразы, который отвечает за копирование. Старая, хорошо отработанная и достаточно точная полимераза при этом неизбежно сменяется на «сырую» и недоработанную. Позже естественный отбор доведет точность новой полимеразы до совершенства, но непосредственно в момент смены РНК на ДНК отбор будет поддерживать старый геном с точной полимеразой. Закрепление замены урацила на тимин еще проблематичнее. Сам по себе тимин ничуть не лучше урацила. Он позволяет находить и исправлять дезаминирование цитозина в геноме, но для этого нужно еще несколько ферментов. Тимин в ДНК выгоднее, чем урацил, когда уже есть система обнаружения урацила в ДНК и замены его на цитозин. Но по отдельности тимидилат-синтаза бесполезна, а система замены урацила вредна, и непонятно, какой из этих ферментов мог возникнуть первым.
Патрик Фортер (Forterre, 2005; Forterre, Prangishvili, 2009) разрешает эту проблему. По его гипотезе эксперименты с новыми полимеразами велись вирусами, а первой выгодой от смены типа генома было ускользание от защитных систем хозяина. Большинство клеток и в наше время используют разные ферментативные системы, опознающие и уничтожающие вирусные ДНК и РНК. «Гонка вооружений» между вирусами и их доклеточными хозяевами могла вызвать очень быструю эволюцию геномных материалов и полимераз для их копирования. И сегодня у вирусов встречаются разнообразные геномные нуклеиновые кислоты, например ДНК с урацилом у бактериофагов PBS1 и PBS2 (Forterre, 2002). Среди вирусов известны ДНК с дополнительными модификациями нуклеотидов: гидроксиметилцитозин у бактериофага T4, гидроксиметилурацил у бактериофага SP01 и 2-аминоаденин у цианофага S-2L (Poole, Logan, 2005). Все эти странные нуклеотиды помогают вирусной ДНК избежать расщепления ферментами хозяина.
Если замена рибозы на дезоксирибозу когда-то позволила вирусу в 10 раз эффективнее заражать жертв ценой 5-кратного роста числа мутаций, то это было выгодное решение. Кроме того, малый размер вирусных геномов смягчает требования к точности копирования. А необходимость долгого автономного существования вирусной частицы без возможности исправить повреждения и без УФ-защиты минералов ужесточает отбор на устойчивость вирусного генома по сравнению с геномом протоклеток. Лишь после отработки в вирусах новые полимеразы были подхвачены их хозяевами (рис. 14.2).
Происхождение систем репликации ДНК
Клеточная ДНК существует в двухцепочечной форме, причем цепи направлены навстречу друг другу. Молекула ДНК-полимеразы, строящая новую цепочку по шаблону старой, всегда двигается в одном направлении – от 3` к 5` концу. Поэтому нельзя просто взять две молекулы ДНК-полимеразы и начать ими синтез двух новых цепей из одной точки двух старых цепей – молекулы ДНК-полимеразы будут двигаться в разные стороны, и большая часть генома в процессе копирования окажется в уязвимой одноцепочечной форме. Чтобы обойти эту сложность, копирование ДНК в клетках идет при помощи специальной молекулярной машины, которая называется «репликативная вилка» и состоит из более чем 20 видов белков. В этом комплексе работа нескольких молекул ДНК-полимеразы согласована так, чтобы не было длинных одноцепочечных участков ДНК.
Как работает репликативная вилка? Прежде всего, двухцепочечную ДНК надо расплести на две отдельные цепи. Это делает фермент хеликаза, молекула которого имеет форму кольца, надетого на двойную спираль ДНК. Хеликаза раскручивает двойную спираль с затратой энергии АТФ. Далее, чтобы одиночные цепи ДНК за хеликазой не соединились обратно в двойную спираль, к ним прикрепляются специальные белки, называемые SSB (single-strand binding – белки, связывающие однонитевую ДНК). После этого на матрице старых цепей ДНК полимеразы могут строить новые цепи. Поскольку цепи направлены навстречу друг другу, а репликативная вилка движется в одну сторону, то копирование двух цепей идет по-разному. Одна старая цепь, по которой репликативная вилка движется от 3` конца к 5`, называется лидирующей. Молекула ДНК-полимеразы просто строит на ней вторую цепь без каких-либо сложностей. По второй старой цепи ДНК (ее называют отстающей) репликативная вилка движется от 5` к 3` концу – в обратную сторону по сравнению с тем, как должна двигаться полимераза. Это противоречие решается через движение полимеразы скачками. Сначала ДНК-полимераза отстающей цепи движется по ней от 3` к 5` концу, строя на ней фрагмент новой цепи (эти куски получили название «фрагменты Оказаки»). Когда длина нового фрагмента достигнет 1000–2000 нуклеотидов, она прекращает синтез и совершает скачок обратно, к 3` концу, на расстояние в две длины фрагментов Оказаки, и оттуда начинает синтез следующего. Точнее, полимераза не совершает скачков, она жестко скреплена с полимеразой лидирующей цепи и другими белками репликативной вилки. Вместо этого отстающая цепь движется через репликативную вилку то в одну, то в другую сторону. Во время синтеза фрагмента Оказаки из вилки выступает все более длинная петля отстающей цепи, а потом она быстро продергивается обратно (рис. 14.3).
Такое поведение полимеразы напоминает историю попугая-контрамота из «Понедельник начинается в субботу». Попугай, который после уникального эксперимента стал жить из будущего в прошлое, сначала попался на глаза героям книги в виде трупа, на второе утро был болен и потом умер, а на третий день оказался живым и здоровым. Однако в пределах одного дня жизнь попугая шла в привычном порядке – он сначала заболел, потом умер; и летал он не задом наперед, а обычным образом.
Такой способ синтеза отстающей цепи – из фрагментов Оказаки – создает свои сложности (рис. 14.4). Все ДНК-полимеразы нуждаются в затравке, или праймере – коротком фрагменте РНК, который комплементарно связан со старой цепью ДНК, и новая цепь ДНК образуется путем удлинения праймера. На отстающей цепи на каждый фрагмент Оказаки нужен свой праймер. Поэтому после работы ДНК-полимеразы новую отстающую цепь обрабатывают еще несколько ферментов. РНКаза Н удаляет РНК-затравки, а вспомогательная ДНК-полимераза вставляет ДНК на их место. Между концом одного фрагмента Оказаки и началом следующего после этого остаются «надрезы» – два соседних нуклеотида новой цепи, между которыми нет связи. Эти надрезы заделывает еще один вспомогательный фермент – ДНК-лигаза. Кроме перечисленных ферментов в репликации участвует еще несколько:
• праймазы делают РНК-затравки, с которых начинается синтез ДНК (один раз – на лидирующей цепи и на каждый фрагмент Оказаки для отстающей цепи);
